Publikacija: Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic

Publikacija: Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic

Ime projekta Vzpostavitev sistema uporabe DNA markerjev za genetsko identifikacijo pri preverjanju sortne pristnosti in čistosti pomembnejših vrst žit in križnic kot osnova za kakovostno pridelavo semenskih posevkov ter varno in kakovostno pridelano hrano in krmo

Šifra / SICRIS

V4-1806

Trajanje projekta

1. 11. 2018–31. 10. 2021

Odgovorni nosilec

 dr. Vladimir Meglič (KIS)

Projektna skupina Seznam raziskovalcev in tehničnega osebja

Sodelujoče organizacije

Kmetijski inštitut Slovenije

Financerja

Bibliografija projekta

SICRIS

  Kratek opis raziskovalnega projekta

Sortna pristnost in kakovostno seme sort, ki so prilagojene slovenskim pridelovalnim razmeram, sta ključnega pomena za uspešno kmetijsko pridelavo in posledično za zagotavljanje prehranske varnosti in zmanjšanje tveganja v kmetijski pridelavi. Nova pravila mednarodne zveze za testiranje semena ISTA (International Seed Testing Association) z dne 1.1.2017 uvajajo bolj zanesljive postopke določitve sortne pristnosti, ki temeljijo na uporabi DNA markerjev. Glede na aktualnost tematike ISTA pripravlja tudi priročnik o preverjanju sortne pristnosti z uporabo metod na osnovi DNA (angl. t.i. DNA-based variety identification), ki bo izšel v letu 2019. ISTA delovna skupina za sortnost v svojem poročilu 2016-2017 poroča o uvajanju SSR (Simple Sequence Repeat) markerjev za pšenico. V splošnem je pri različnih vrstah najbolj široko uporabljeno molekulsko orodje prav aplikacija SSR markerjev, za določene rastlinske vrste pa je v fazi uvajanja tudi genotipizacija z uporabo še preciznejših SNP (Single Nucleotide Polymorphism) markerjev (ISTA News Bulletin, 154, October 2017). V okviru delovne skupine OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) Seed Schemes je bila Služba za uradno potrjevanje semenskega in sadilnega materiala kmetijskih rastlin (SUP) na Kmetijskem inštitutu Slovenije kot slovenski certifikacijski organ pozvana, da se opredeli glede izvajanja biokemičnih in molekulskih analiz za preverjanje sortne čistosti, identifikacije ter hibridizacije znotraj posameznih rastlinskih vrst, za katere bi lahko izvajali analize. Tudi s te strani je močan poudarek na aplikaciji DNA markerjev na račun opuščanja analiz na osnovi biokemičnih markerjev. V zadnjem obdobju si žlahtnitelji vse bolj prizadevajo, da bi imela vsaka sorta ob svojem opisu predpisano tudi metodiko genetske identifikacije ter dostopen genetski profil določenih lokusov v genomu, na podlagi katerih se sorte med seboj zanesljivo in učinkovito loči. Posledično se v smislu zaščite žlahtniteljskih pravic (angl. breeders rights) žlahtnitelji vedno bolj poslužujejo uporabe novih zanesljivih metod, ki sorte med seboj učinkovito ločijo in to je z uporabo DNA markerjev. Dejansko se tudi pri potrjevanju semenskih posevkov tekom vegetacije pojavlja problem identifikacije sort netipičnih rastlin predvsem znotraj vrst žit in križnic. Uporabnost genetske identifikacije sort se kaže pri analizah kakovosti semena v laboratoriju, ko se na osnovi morfoloških znakov semena pri analizi čistote in klic v postopku kalivosti pojavlja sum na drugo sorto, vrsto ali celo rod. Nove sorte so si namreč vedno bolj morfološko podobne zato je njihova identifikacija na osnovi vidnih znakov vedno težja. Znotraj predlaganega projekta želimo vzpostaviti zanesljivo in učinkovito genetsko orodje, s pomočjo katerega bomo v primeru dvoma na nivoju fenotipsko izraženih lastnosti pri preverjanju sortne čistosti in pristnosti tako posevkov kot tudi vzorcev semena, ciljno identificirali rod/vrsto/sorto pomembnejših predstavnikov znotraj žit in križnic. Vzpostavljen sistem z uporabo molekulskih markerjev bi nam tako omogočil genomsko-specifično in sortno ločevanje predvsem znotraj/med vrstami žit in križnic, ki se v pridelujejo Sloveniji. Preko vzpostavljenih metod in z njihovo uporabo bomo lahko nudili podporo tudi pri nadzoru PRP, predvsem pri podukrepu GEN_SOR. Cilji predlaganega projekta so:

-  Razvoj in vzpostavitev sistema za genetsko identifikacijo rodu/vrste/sorte z uporabo DNA markerjev pri agronomsko pomembnih vrstah žit in križnic, ki so vpisane na slovenski ali evropski sortni listi ter se njihov material prideluje ali uradno potrjuje v Sloveniji (npr. Triticum aestivum L. Emend. Fiori et Paol. (navadna pšenica); Brassica napus L.(partim.) (navadna ogrščica); Fagopyrum esculentum (Moench) (navadna ajda); Hordeum vulgare L. (navadni ječmen); itd). Poleg tega bo nabor vključeval tudi vrste, ki jih je na nivoju fenotipa in morfoloških karakteristik semena, klic ali rastlin v semenski pridelavi težko identificirati in razločevati.

-  Prilagoditev obstoječih postopkov uradnega potrjevanja oziroma metod preverjanja sortne pristnosti in čistosti ter ugotavljanja dovoljenega deleža netipičnih rastlin (samoprašnih v primeru hibridnih sort) in rastlin druge sorte v semenskih posevkih in v partijah semena tako, da bo poleg konvencionalnih metod, z uporabo sistema DNA markerjev kot dodatnim orodjem v primeru dvoma, identifikacijo možno izvesti že v prvi fazi postopka uradnega potrjevanja, kar bo prispevalo k boljši kakovosti semena na trgu.

-   Priprava metodoloških dokumentov in informacij za vzpostavitev baz podatkov o alelnih profilih sort, ki so vpisane v sortno listo in se njihov material prideluje oz. uradno potrjuje v Sloveniji.

Aktivnosti, izvedene v letih 2019 in 2020

- Oblikovanje seznamov sort, ki smo jih po pregledu veljavne SLO sortne liste in semenske pridelave preko uradnih standardnih vzorcev vključili v CRP, vključno s podatkom o tem, katero vrsto standardnega vzorca že hranimo.

- Izbor DNA markerjev. Skupno smo za namene genotipizacije in priprave genetskih profilov izbrali 46 različnih DNA markerjev, ki vključujejo 3 različne markerske sisteme; 43 tipa SSR (angl. Short Seguence Repeat), 2 tipa SCAR (angl. Sequence Characterizied Amplified Region) in enega tipa CAPS (angl. Cleaved Amplified Polymorphic Sequences).

- Priprava vzorcev žit in križnic ter analiza klic, nakaljenih sort v semenskem laboratoriju.

- Optimizacije priprave vzorcev ter ekstrakcije DNA iz listnega tkiva žit in križnic.

- Optimizacije reakcijskih mešanic in temperaturnih profilov identificiranih DNA markerjev.

- Optimizacije ter izvedba najbolj ustreznih post-PCR postopkov in metod detekcije med/znotraj posameznimi skupinami vrst v projektu.

Povzetek zaključenega projekta

Sortna pristnost in kakovostno seme sort, ki so prilagojene slovenskim pridelovalnim razmeram, sta ključnega pomena za uspešno kmetijsko pridelavo in posledično za zagotavljanje prehranske varnosti in zmanjšanje tveganja v kmetijski pridelavi. Novejša pravila mednarodne zveze za testiranje semena ISTA (International Seed Testing Association) uvajajo bolj zanesljive postopke določitve sortne pristnosti, ki temeljijo na uporabi DNA markerjev. V okviru delovne skupine OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) Seed Schemes je bila Služba za uradno potrjevanje semenskega in sadilnega materiala kmetijskih rastlin (SUP) na Kmetijskem inštitutu Slovenije kot slovenski certifikacijski organ pozvana, da se opredeli glede izvajanja biokemičnih in molekulskih analiz za preverjanje sortne čistosti, identifikacije ter hibridizacije znotraj posameznih rastlinskih vrst, za katere bi lahko izvajali analize. Tudi s te strani je močan poudarek na aplikaciji DNA markerjev na račun opuščanja analiz na osnovi biokemičnih markerjev. V zadnjem obdobju si žlahtnitelji vse bolj prizadevajo, da bi imela vsaka sorta ob svojem opisu predpisano tudi metodiko genetske identifikacije ter dostopen genetski profil določenih lokusov v genomu, na podlagi katerih se sorte med seboj zanesljivo in učinkovito loči. Posledično se v smislu zaščite žlahtniteljskih pravic žlahtnitelji vedno bolj poslužujejo uporabe novih zanesljivih metod, ki sorte med seboj učinkovito ločijo, z uporabo DNA markerjev. V praksi se tudi pri potrjevanju semenskih posevkov tekom vegetacije pojavlja problem identifikacije sort netipičnih rastlin, predvsem v posevkih žit in križnic. Uporabnost genetske identifikacije sort se kaže pri analizah kakovosti semena v laboratoriju, ko se na osnovi morfoloških znakov semena pri analizi čistote in klic v postopku kalivosti pojavlja sum na drugo sorto, vrsto ali celo rod. Nove sorte so si namreč vedno bolj morfološko podobne zato je njihova identifikacija na osnovi vidnih znakov vedno težja.

Za namene izvedbe projektnih aktivnosti smo najprej oblikovali sezname sort, ki smo jih po pregledu veljavne SLO sortne liste in semenske pridelave preko uradnih standardnih vzorcev vključili v CRP, vključno s podatkom o tem, katero vrsto standardnega vzorca že hranimo. Skupno smo v projekt vključili 54 sort žit in križnic. V analizah, ki so bile izvedene v ISTA akreditiranem Semenskem laboratoriju KIS smo za vsako sorto opravili analizo kakovosti semena (določili čistoto in kalivost) po veljavnih ISTA protokolih. Na podlagi morfologije semena smo oblikovali podskupine, v primeru da se je seme iste sorte med seboj morfološko razlikovalo. Seme in mlade rastline vsake sorte smo tudi fotografirali. Po končanih analizah v semenskem laboratoriju smo mlade rastline odnesli v Genetski laboratorij KIS za analize z DNA markerji. Vsaka izmed 54-ih sort je bila v genotipizaciji zastopana s 4-imi (za samoprašne rastlinske vrste) ali z 8-imi (za tujeprašne rastlinske vrste) individualnimi rastlinami, da smo lahko pridobili tudi informacijo o variabilnosti znotraj sorte in frekvencah alelov. Skupno smo v analize vključili 277 vzorcev. Sledila je optimizacija ekstrakcije DNA za vsak sklop rastlinske vrste posebej. Preizkusili smo 6 različnih protokolov ekstrakcije DNA, odvisno od vrste pa smo uporabili tri različne protokole (ekstrakcija z uporabo treh komercialnih kitov in/ali uporaba avtomatiziranega sistema za ekstrakcijo nukleinskih kislin). Nadalje smo za namene genomsko-specifičnega in sortnega ločevanja znotraj/med vrstami žit in križnic na podlagi podatkovnih baz ter znanstvenih člankov identificirali 46 različnih DNA markerjev, ki vključujejo 3 različne markerske sisteme; 43 tipa SSR (angl. Short Seguence Repeat), 2 tipa SCAR (angl. Sequence Characterizied Amplified Region) in enega tipa CAPS (angl. Cleaved Amplified Polymorphic Sequences). Za razločevanje znotraj kompleksa vrst pšenica/rž/tritikala/pira smo uporabili 13 DNA markerjev; za razločevanje znotraj rodu Avena 7 DNA markerjev; za razločevanje znotraj rodu Hordeum 6 DNA markerjev; za raznolikost in razločevanje znotraj in med navadno in tatarsko ajdo 11 DNA markerjev; za raznolikost in razločevanje znotraj in med vrstami družine Brassicaceae pa 9 DNA markerjev. Za vsak marker posebej smo optimizirali reakcijske mešanice in pogoje namnoževanja v verižni reakciji s polimerazo (PCR) ter v fragmenti analizi za pridobitev kvalitativnega (prisotnost/odsotnost namnožka na posameznem lokusu) in kvantitativnega (alelnega) profila sorte. Rezultati fragmentne analize z alelnimi profili sorte v obliki kodominantnih matrik so zahtevali dodatno obdelavo s statističnimi programi in orodji populacijske genetike za pridobitev informacije o frekvencah alelov in intra-specifične raznolikosti znotraj posamezne sorte. Rezultati bodo del obsežnega metodološkega dokumenta, ki ga pripravljamo. V projektu smo empirično določili tudi meje detekcije, torej najmanjši možni delež, ki dejansko predstavlja prisotnost netipičnih rastlin v združenem vzorcu/posevku in smo ga s standardnim PCR na kvalitativnem nivoju sposobni določiti. Ugotovili smo, da na kvalitativnem nivoju lahko detektiramo že zelo majhne razlike v genomu za posamezen marker, če le-te obstajajo. Vsak izmed specifičnih SSR markerjev, za katere smo določili, da na nivoju detekcije namnožka na gelu/kvalitativne detekcije, uspešno razločujejo med starši in križanci pri stopnji 1% deleža netipičnih rastlin. Če bi želeli določiti razlike v nižjih deležih netipičnih rastlin (torej 0,1 % in/ali 0,3 % po shemi za različne kategorije certificiranega semena) bi morali analizo nadaljevati na nivoju alelne detekcije (dražja in časovno ter metodološko bolj zahtevna analiza), ki določi razlike med genotipi na en bazni par natančno, kar je optimalno in popolnoma zanesljivo. Na podlagi kvantitativnih rezultatov smo izrisali tudi filogenetsko drevo, ki nam kaže, da smo na kvalitativnem nivoju sposobni ločevati tudi deleže netipičnih rastlin, ki so nižji od 1 %, vendar z nižjo zanesljivostjo.

Glavni cilj projekta je bil dosežen. Vzpostavili smo sistem zanesljive identifikacije sort žit in križnic s pomočjo DNA markerjev, kar nam omogoča hitro in učinkovito ter finančno sprejemljivo preverjanje sortne pristnosti in čistosti tako v postopku uradnega potrjevanja semena žit in križnic, kakor tudi v sami pridelavi. Vzpostavljene protokole ter sortno/vrstno specifične DNA markerje je mogoče uporabljati tudi za določanje pristnosti lokalnih sort ter pri nadzoru varne hrane, saj lahko na podlagi testov ciljno primerjamo posejane sorte žit s tistimi v skladišču oziroma specifično moko. Metode smo validirali na dejanskih vzorcih, ki so bili v analizo posredovani na KIS/SUP in smo jih razvrstili v naslednje sklope: ločevanje navadnega in golega ovsa; ločevanje pšenice, pire in tritikale; ločevanje oljne ogrščice in oljne repice; identifikacija netipičnih rastlin znotraj semenskega posevka ječmena; identifikacija netipičnih rastlin v semenskem posevku navadne ajde. Prav tako smo vzpostavili na nacionalnem nivoju krovni dokument, ki metodološko opredeljuje postopke identifikacije sort žit in križnic ter baze podatkov z genskimi profili sort/frekvencami alelov, ki so v Sloveniji vpisane v sortno listo ali se njihov material uradno potrjuje. Ta dokument bo v tiskani obliki širši javnosti in vsem zainteresiranim na voljo do poletja 2022. Na podlagi podatkov v omenjenem dokumentu bomo lahko v Genetskem laboratoriju na KIS hitro in zanesljivo izvedli genetske analize, ki bodo učinkovito odpravile dvom o sortni pristnosti in čistosti, tako za potrebe certifikacijskega organa (v skladu s priporočili OECD), kakor tudi za potrebe ISTA akreditiranega laboratorija, inšpekcijske službe, UVVHR-ja, MKGP-ja ter tudi pridelovalcev, uvoznikov semena in žlahtniteljev.

Publikacija: Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic (.pdf)